단편영화 〈사이에 두고〉를 통해 데뷔했으며 2005년 영화 《사랑니》에 출연해 평단의 주목을 받으며 백상예술대상, 한국영화평론가협회상 등 각종 시상식에서 신인상을 휩쓸었다. 본인 스스로도 이 영화를 직업 배우로서 데뷔작으로 생각하며 자신에게 매우 의미있는 영화임을 밝히기도 했다.2006년 영화 《가족의 탄생》에서 남자친구인 봉태규의 속을 뒤집어 놓는 아주 착한 여자친구 역을, 2007년 드라마 《케세라세라》에서 사랑스러운 여주인공 역을 맡아 자신만의 매력을 한껏 드러냈다. 특히 《가족의 탄생》으로 본격적인 각광을 받기 시작하며 2006년 제27회 청룡영화상 여우조연상을 수상하는 쾌거를 이룬다. 이에 정유미는 본인의 수상을 전혀 예상하지 못했는지 시상대에 올라와서 얼굴이 붉어져서 어버버하며 수줍게 수상 소감을 말하는 모습을 보여주기도 했다.특유의 독특한 감수성 때문에 평단이나 영화광들에게 인기가 높은데 영화평론가 정성일은 자신의 데뷔작인 독립영화 《카페 느와르》에 그를 캐스팅한 일화를 GV에서 다음과 같이 회고했다.